Cell Reports | 福建農林大學聯合天津大學開發(fā)植物新型DNA大片段重組系統(tǒng)，實現DNA大片段高效定向整合

定向整合大片段DNA至植物基因組是合成生物學和植物基因工程領域的急需技術。近年來，研究人員一直在探索一種能夠在植物體內敲入大片段DNA的基因組定點編輯技術。但目前植物中的定向整合系統(tǒng)仍存在諸多不足，如CRISPR-Cas9系統(tǒng)會產生DNA雙鏈斷裂（DSB），造成基因片段的插入與缺失、染色體碎裂和染色體易位等；由CRISPR-Cas9系統(tǒng)發(fā)展而來的引導編輯系統(tǒng)和GRAND編輯系統(tǒng)雖然減少了對DSB的依賴，但均不能在植物基因組插入超過1kb的DNA片段，且編輯效率較低；轉座酶基因敲入系統(tǒng)雖然能夠在無需DSB的情況下整合DNA大片段到植物基因組中，且不依賴宿主重組，但其整合位點通常為半隨機且缺乏拷貝數的控制；另外，經典的酪氨酸重組酶，如Cre和FLP，雖已廣泛用于真核生物基因組的改造，但是它們的重組事件通常是可逆的。

近日，福建農林大學聯合天津大學在Cell Reports雜志上發(fā)表了題為Efficient site-specific integration of kilobase-length DNA fragments in plant cells via Kp03 recombinase的研究論文，報道了利用Kp03大絲氨酸重組酶在植物細胞中進行高效靶向DNA大片段整合的研究。

研究團隊首先在植物細胞中利用三質粒系統(tǒng)評估了Kp03大絲氨酸重組酶在質粒水平上的整合能力。在水稻和擬南芥原生質體中，Kp03介導的重組效率分別高達99.1%和94.4%，且該重組酶在植物細胞內的活性不需要額外的輔助因子。

為進一步明確Kp03系統(tǒng)能夠整合的最大DNA片段長度，研究團隊設計了一系列不同長度的供體DNA,結果表明Kp03可在植物細胞中實現最長達27.3kb的外源DNA片段的高效整合，顯著突破了現有技術在整合容量上的限制。另外，為優(yōu)化重組元件的最小化設計，研究人員系統(tǒng)截短了Kp03 attB序列，發(fā)現當其長度縮短至15bp時仍保留一定一定的整合能力。更為重要的是，通過基因序列比對，在水稻基因組序列中找到了一段與Kp03 attB 15bp完全相同的水稻內源序列。在此位點，不需要提前安裝Kp03 attB附著墊序列就可將3.4kb外源DNA序列整合到該目標位點中。眾所周知，當前位點特異性重組酶與引導編輯器需要聯合使用才能在植物中實現kb級大片段的DNA定點插入，但Kp03系統(tǒng)能夠通過一步法直接在水稻基因組中實現kb級的外源DNA大片段的整合。不過，Kp03 attB序列長度為15bp時，Kp03的重組能力較低，為了克服這個限制，研究人員通過NM-PE系統(tǒng)在水稻基因組中精準插入了Kp03 attB 26bp序列，構建出可用于整合的底盤細胞，并通過基因槍轟擊方法，成功將3.4kb的外源大片段DNA整合至該目標位點，并獲得了穩(wěn)定的轉基因水稻材料。

綜上所述，研究人員在植物中開發(fā)了一種新型的Kp03大片段基因敲入系統(tǒng)，該系統(tǒng)在質粒水平上實現了27kb以上的DNA大片段整合，并通過一步法將外源3.4kb的DNA片段成功整合到水稻原生質體基因組中，此外，該系統(tǒng)與NM-PE系統(tǒng)聯合使用，獲得了含有3.4kb外源大片段精準插入的水稻植株，實現了植物體內定點大片段整合，為植物合成生物學研究和分子育種提供了強有力的技術支持。

福建農林大學熊延教授課題組的青年教師閆大琦、孟彥彥和張楠為本文的共同第一作者，福建農林大學熊延教授、天津大學溫明章教授和福建農林大學朱曉玥教授為本文共同通訊作者。該工作得到了中國農業(yè)科學院周煥斌研究員、福建農林大學徐通達教授和劉巖林教授、清華大學陳浩東教授的幫助和大力支持。該研究得到了國家重點研發(fā)計劃項目、國家自然科學基金、福建省自然科學基金和福建農林大學等的經費資助。

論文鏈接：

https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(25)01279-3