探秘記憶 B 細胞監(jiān)測：ImmunoSpot 技術(shù)為何成關(guān)鍵？

摘要：傳統(tǒng)通過檢測血液中抗體水平評估體液免疫的方式存在局限，抗體滴度會隨時間下降，無法真實反映既往抗原暴露和免疫記憶情況。而記憶 B 細胞作為體液免疫的 “第二道防線”，其功能評估對理解機體免疫能力至關(guān)重要。本文從記憶 B 細胞與漿細胞的分化差異、抗體檢測的局限性出發(fā)，介紹了新一代 B 細胞 ImmunoSpot檢測技術(shù)（包括 ELISPOT和FluoroSpot）的原理、優(yōu)勢，以及該技術(shù)在記憶 B 細胞的 Ig 類別/亞類鑒定、親和力分布量化、交叉反應性分析等方面的應用，揭示其為免疫診斷帶來的全新突破。

一、體液免疫的 “兩層防線”：抗體與記憶 B 細胞

我們常通過檢測血液里的抗體來判斷是否對某種病原體有免疫力，比如新冠、流感疫苗接種后查抗體滴度，這是因為抗體是體液免疫的第一道防線?？贵w由漿細胞分泌，這些漿細胞能在骨髓等特殊環(huán)境中長期存活，持續(xù)釋放抗體，形成抵御病原體入侵的 “即時屏障”。但抗體的半衰期很短，像 IgG1、IgG2 的半衰期約 21-28 天，IgE 更是只有 2-3 天，一旦漿細胞分泌的抗體補充不上，血液中的抗體水平就會快速下降。

更關(guān)鍵的是，抗體水平并不能代表免疫的 “后勁”——記憶 B 細胞（Bmem）才是體液免疫的第二道防線。當首次感染或接種疫苗后，部分 B 細胞會分化為記憶 B 細胞，它們靜靜 “潛伏” 在體內(nèi)，一旦再次遇到相同或變異的病原體，就能迅速活化、增殖，分化為漿細胞分泌抗體，還能通過親和力成熟產(chǎn)生更強效的抗體。有意思的是，漿細胞和記憶 B 細胞的分化由 B 細胞受體（BCR）的親和力決定：高親和力的 B 細胞會留在生發(fā)中心繼續(xù)分化為漿細胞，而低親和力的 B 細胞則會離開生發(fā)中心成為記憶 B 細胞（見圖 1）。這也導致血液中抗體水平和記憶 B 細胞的頻率往往并不一致，只看抗體，很可能低估了機體的實際免疫能力。

二、只測抗體不夠用：那些被忽略的免疫真相

傳統(tǒng)的血清抗體檢測存在明顯的 “盲區(qū)”。研究團隊在對新冠、EB 病毒、季節(jié)性流感的研究中發(fā)現(xiàn)，很多人經(jīng) PCR 證實感染過新冠，但血液中幾乎檢測不到新冠抗體，卻能發(fā)現(xiàn)高頻的新冠特異性記憶 B 細胞；在人類巨細胞病毒（HCMV）的研究中也有類似現(xiàn)象，記憶 B 細胞（和 T 細胞）存在的情況下，血液中卻沒有特異性抗體。這意味著，血清抗體陰性的人，可能其實已經(jīng)接觸過抗原，只是抗體水平下降到檢測不到，而記憶 B 細胞還 “記得” 這次遭遇（見圖 2）。

這種 “抗體陰性但記憶 B 細胞陽性” 的情況，在血液捐獻篩查中也帶來了隱患。比如 HCMV 對免疫抑制人群有致命風險，但常規(guī)的血清學檢測可能漏掉那些已經(jīng)感染、但抗體水平低的捐獻者，而檢測記憶 B 細胞能更準確地判斷既往暴露情況。此外，當病原體發(fā)生變異（如新冠、流感的變異株），原本的抗體可能無法識別，但記憶 B 細胞能對變異的異源抗原產(chǎn)生交叉反應，快速啟動二次免疫，這也是只測抗體無法預判的免疫潛力。

三、ImmunoSpot 技術(shù)：給記憶 B 細胞做 “精準體檢”

既然記憶 B 細胞這么重要，為什么之前很少被納入免疫檢測？主要是傳統(tǒng)的直接抗原包被方法對大多數(shù)抗原效果差，要么檢測不到特異性抗體分泌細胞（ASC），要么需要極高濃度的抗原，成本高還信號弱。而新一代ImmunoSpot 技術(shù)（包括 ELISPOT 和 FluoroSpot）解決了這個難題，核心秘訣是親和捕獲包被法。

傳統(tǒng)方法是把抗原直接涂在檢測膜上（見圖 3A），靠疏水作用結(jié)合，穩(wěn)定性和密度都差；親和捕獲包被法則先在膜上涂抗標簽抗體（比如抗 His 標簽），再結(jié)合帶標簽的重組抗原（見圖 3B），通過特異性的高親和力結(jié)合，實現(xiàn)抗原的高密度、穩(wěn)定包被，而且能檢測幾乎所有帶標簽的抗原。除此之外，ImmunoSpot 還有兩種關(guān)鍵檢測模式：泛 Ig 檢測（見圖 3C）能捕捉所有抗體分泌細胞的分泌足跡，不管其抗原特異性；反向抗原特異性檢測（見圖 3D）則先捕獲抗體，再用抗原探針識別特異性，進一步提升檢測精準度。

和流式細胞術(shù)相比，ImmunoSpot 的優(yōu)勢也很突出：它能檢測到每 10 萬個 PBMC 中 1 個抗體分泌細胞，靈敏度遠超流式；所需的細胞量更少，不到 500 萬個冷凍 PBMC 就能檢測針對某一抗原的記憶 B 細胞分泌的所有 Ig 類別和亞類；而且技術(shù)門檻更低，即使是 4 色 B 細胞 ImmunoSpot 檢測，也比多參數(shù)流式更容易操作，還能實現(xiàn)全自動化分析。

四、ImmunoSpot 的 “超能力”：解鎖記憶 B 細胞的更多秘密 （一）鑒定 Ig 類別/亞類，預判免疫反應類型

不同的免疫球蛋白（Ig）類別和亞類有不同的效應功能，比如 IgG1 擅長激活補體，IgA 適合黏膜免疫。ImmunoSpot 能在單細胞水平上，統(tǒng)計分泌特定 Ig 類別 /亞類的抗原特異性記憶 B 細胞頻率，還能分析它們在整個抗體分泌細胞中的占比。由于記憶 B 細胞再次活化后，會主要分泌和母代細胞相同類別的抗體，通過這項檢測，我們能預判未來機體遭遇抗原時，會產(chǎn)生哪種類型的抗體反應，這對評估疫苗效果、制定免疫策略至關(guān)重要。

（二）量化親和力分布，評估免疫保護力

記憶 B 細胞的 BCR 親和力直接決定了抗體的保護效果：低親和力抗體需要比高親和力抗體多 10 萬倍的數(shù)量，才能達到相同的抗原結(jié)合效果。ImmunoSpot 能通過 “反向檢測法” 和 “抗原濃度滴定法”，分析抗原特異性記憶 B 細胞的親和力分布。比如先確定抗原特異性 IgG1 + 抗體分泌細胞的頻率，再用不同濃度的抗原探針做檢測，高濃度探針能檢測到所有特異性細胞，低濃度探針則只能檢測到高親和力細胞，通過統(tǒng)計不同濃度下的陽性信號，就能畫出親和力分布曲線，判斷記憶 B 細胞的實際保護潛力。

（三）分析交叉反應性，應對病原體變異

當病原體變異（如新冠變異株），同源抗體可能失效，但記憶 B 細胞可能對異源抗原產(chǎn)生交叉反應。ImmunoSpot 能通過兩種方式檢測這種交叉反應：一是平行檢測同源和異源抗原的抗體分泌細胞頻率，做低分辨率對比；二是用 “最佳細胞輸入量”（約 50 個陽性信號/孔），同時加入同源和異源抗原探針，通過競爭標記分析交叉反應的程度，甚至能評估異源抗原特異性記憶 B 細胞的親和力分布，為應對變異病原體提供關(guān)鍵數(shù)據(jù)。

五、總結(jié)：ImmunoSpot 讓免疫診斷更 “有深度”

過去我們只靠抗體檢測評估體液免疫，就像只看冰山露出水面的一角；而 ImmunoSpot 技術(shù)讓我們能看到水下的 “冰山主體”—— 記憶 B 細胞。這項技術(shù)不僅能更準確地判斷既往抗原暴露，還能揭示機體對未來病原體挑戰(zhàn)的免疫潛力，無論是疫苗效果評估、自身免疫病診斷，還是血液捐獻篩查，都有巨大的應用價值。

隨著親和包被法、自動化分析軟件的不斷完善，ImmunoSpot 也能滿足臨床檢測的嚴格要求，未來有望成為免疫診斷的常規(guī)手段。畢竟，真正的免疫保護，從來不是只看當下的抗體水平，更要看那些默默 “記仇” 的記憶 B 細胞。