Nat. Commun.|病毒復制過程中的宿主因子：基于復制子的全基因組CRISPR敲除篩選方法

病毒如何利用宿主細胞機制進行RNA復制？這一問題對理解病毒生物學、宿主范圍和抗病毒藥物開發至關重要。傳統全基因組CRISPR敲除篩選常受病毒入口階段主導，難以專攻復制依賴因子。近日，一項研究引入病毒復制子系統，成功識別三種RNA病毒的復制特異宿主因子，為病毒學提供新工具。

2025年12月10日，在《Nature Communications》期刊在線發表題為“Replicon-based genome-wide CRISPR knockout screening for the identification of host factors involved in viral replication”的文章，該研究由美國Chan Zuckerberg Biohub的研究團隊主導此項工作，并與美國國家過敏和傳染病研究所合作。該團隊針對登革病毒2型（DENV-2，正鏈RNA病毒，Flaviviridae科）、基孔肯雅病毒（CHIKV，正鏈RNA病毒，Togaviridae科）和埃博拉病毒（EBOV，負鏈RNA病毒，Filoviridae科）進行篩選，這些病毒代表不同復制策略和家族，具有顯著公共衛生意義。復制子CRISPR敲除（KO）篩選在生物安全二級（BSL-2）條件下繞過病毒入口和出口，專注識別復制必需基因。該方法補充活病毒篩選的不足，并驗證候選基因在活病毒感染中的作用。

傳統篩選的局限：入口偏倚與下游因子缺失

病毒生命周期包括入口、翻譯、復制、組裝和出口。全基因組CRISPR敲除篩選通過細胞存活選擇鑒定宿主因子，曾快速解析SARS-CoV-2機制。但結果常變異大，入口因子（如受體）主導，復制因子易被忽略。例如，DENV-2活病毒篩選反復識別內質網膜蛋白復合體（EMC）和寡糖轉移酶（OST），但某些RNA結合蛋白（如ASCC3、RRBP1）僅在部分篩選中出現。CHIKV篩選限于入口受體MXRA8和復制因子FHL1。EBOV高致死率要求BSL-4操作，限制篩選規模。

這些局限源于病毒生物學：多受體使用、復制動力學差異等。變異方法如熒光激活細胞分選（FACS）黃熱病毒篩選或嵌入gRNA的病毒基因組篩選已識別部分下游因子，但缺乏專攻復制的通用平臺。復制子——去除結構基因的亞基因組RNA——保留非結構基因編碼復制酶，用熒光報告子（如eGFP）替換，提供自主復制而不產生感染顆粒的系統。

方法創新：穩定復制子細胞系的構建與篩選

團隊開發可擴展策略生成穩定復制子細胞系，使用Huh7.5.1-Cas9細胞，確保報告子表達均勻（>80% eGFP陽性）和對抑制敏感。以DENV-2基準：基于16681株，插入eGFP-Zeocin融合盒子，添加PEST序列縮短eGFP半衰期。Western blot確認NS2B、NS3、NS4B表達；RNA聚合酶抑制劑7-deaza-2'-C-methyladenosine（MK-0608）劑量依賴降低信號；EMC/OST敲除抑制eGFP。

篩選用Brunello gRNA文庫（全基因組覆蓋）轉導細胞，FACS分選eGFP低群（復制受阻），高通量測序分析gRNA豐度，MAGeCK軟件計算基因富集。類似擴展至CHIKV（基于LR-2006 OPY1株，優化eGFP-Zeocin）和EBOV（整合4cis系統：NP、VP35、VP30、L基因，支持負鏈小基因組復制）。

DENV-2篩選結果：已知復合體與新型翻譯調控因子

DENV-2篩選富集已知復制必需復合體：EMC、OST、內質網相關降解（ERAD）和ER轉位子。基因本體（GO）分析突出ER相關通路，與文獻一致。比對先前Huh7.5.1活病毒篩選，共享核心因子，但復制子獨家識別15基因，包括DOHH、PRKRA、SEL1L、SENP1、UBE2G2、ZFP36L2。其中，SEL1L曾在DENV-2插入突變篩選中出現，UBE2G2參與ERAD，在西尼羅病毒中調控蛋白穩態。

驗證：單個敲除在復制子細胞減少eGFP（DOHH等6個顯著）。活DENV-2感染（MOI=0.1，48 h）用熒光素酶報告病毒和RT-qPCR確認，敲除降低病毒蛋白和RNA水平（如PRKRA敲除RNA降至對照60%）。

CHIKV篩選結果：壓力顆粒與高爾基體運輸依賴

CHIKV復制子優化后穩定表達（>90% eGFP），敲除G3BP1（與nsP3互作）降低信號，MXRA8（入口因子）無影響。篩選富集18基因：壓力顆粒（CSDE1、G3BP1/2）、高爾基運輸（EPS15L1、GOLGA7、SEPTIN6）、翻譯后修飾（BAG6、PCBD1、POFUT2）、轉錄調控（CEBPA等）和雜類。

驗證CSDE1（RNA結合蛋白，調控壓力顆粒）和GOLGA7（高爾基膜組件，涉運輸）。活CHIKV感染（LR-2006 OPY1，MOI=0.1）RT-qPCR顯示，CSDE1/GOLGA7敲除延緩RNA積累（25 h低于對照70%），G3BP2影響更強，與文獻一致。這反映CHIKV復制復合體在質膜球狀體形成，依賴壓力顆粒動態（nsP3劫持G3BP避免防御）和高爾基-質膜交通。

EBOV篩選結果：組蛋白修飾酶與泛素化途徑的角色

EBOV復制子整合4cis系統（NP、VP35、VP30、L），轉錄Zeocin-eGFP小基因組，穩定>90% eGFP。敲除L或DYNLL1（已知復制因子）降低信號，NPC1（入口受體）無影響。篩選富集獨特基因：組蛋白修飾酶（EHMT1/2、EP300）、泛素家族（FBXO28、USP7/12）、磷酸酶/激酶（DUSP6/18、PPP1R12B/3CB、PRKC1）、免疫球蛋白超家族（CD19、ICAM4）和轉錄調控因子（NRIP1、PSIP1、ZNF182/865）。

驗證七個一致命中和九個額外基因：EHMT1、EHMT2、USP7顯著降低eGFP。鏈特異RT-qPCR顯示敲除減少vRNA、cRNA、mRNA。瞬時轉染確認不是4cis整合效應，4cis蛋白表達不變。這暗示EHMT1/2（賴氨酸甲基轉移酶）和USP7（去泛素酶）調控EBOV復制，可能通過非組蛋白甲基化或VP35/NP泛素化，與Sendai病毒包容體形成類似。

結果驗證與比較：病毒特異性與方法可靠性

候選基因使用單個敲除、流式細胞術、Western blot和RT-qPCR驗證，編輯效率高。DENV-2和CHIKV在活感染確認，EBOV用瞬時系統。比較顯示特異性：DENV-2偏ER蛋白穩態，CHIKV涉壓力和高爾基，EBOV偏表觀遺傳調控，與HEV早期內體依賴不同。

方法魯棒：Brunello覆蓋全，MAGeCK分析可靠。RNA測序顯示DENV-2復制子穩定（99.9%匹配）。局限包括報告子偏倚和培養漂移，但交叉驗證緩解。

研究觀點：補充工具與潛在應用

復制子CRISPR篩選補充活病毒方法，專注下游因子，適用于BSL-2，揭示病毒特異機制。該研究報告新因子，如DENV-2翻譯調控和EBOV甲基轉移酶作用。這些提供宿主導向抗病毒靶點，減少潛在風險。

展望：擴展至更多病毒，結合CRISPRi/a分析必需基因，或蛋白質組學繪網絡，深化病毒-宿主互動。最終，或開發廣譜藥物靶向保守通路，如EMC/OST，應對疫情。

原文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41467-025-65979-3