同濟大學杜建忠教授團隊AM：新型氧化還原調(diào)控相變肽液滴：為靜脈遞送生物藥物開辟新路徑

在生命科學領域，生物分子通過液-液相分離形成的凝聚體對細胞功能至關重要，其動態(tài)的液-固態(tài)相變調(diào)控著一系列生化活動。然而，如何構建具有可控、可逆相變能力的人工凝聚體，以模擬這種精巧的自然機制并用于生物醫(yī)藥應用，尤其是實現(xiàn)靜脈給藥過程中的穩(wěn)定遞送和靶點釋放，一直是該領域面臨的關鍵挑戰(zhàn)。

近日，同濟大學杜建忠教授、范震教授、孫敏博士團隊報道了一種氧化還原調(diào)控的、具有抗降解能力的相變肽液滴。該體系可通過匹配體內(nèi)微環(huán)境，利用氧化還原反應精準控制肽凝聚體在液體與固體狀態(tài)之間的可逆循環(huán)切換，并成功應用于靜脈遞送siRNA，在胰腺癌模型中顯示出顯著的腫瘤抑制效果。這一成果為操控生物分子相分離以遞送生物藥物開辟了新前沿。相關論文以“Redox-Regulated Phase Switchable Peptide Droplets with Degradation Resistance for Intravenous Delivery of Biopharmaceuticals”為題，發(fā)表在

Advanced Materials

研究團隊首先設計并合成了基于“粘性位點-間隔基”策略的模型肽YHssHY。通過系統(tǒng)地研究肽濃度、鹽濃度、pH和溫度等參數(shù)，團隊繪制了其液-液相分離相圖。研究顯示，在酸性條件及適宜的鹽濃度下，YHssHY能夠自組裝形成無膜的液態(tài)液滴。這些液滴展現(xiàn)出典型的相分離特征，如成核、生長和液滴融合。分子動力學模擬揭示了其中的分子作用機制：酪氨酸和組氨酸作為“粘性位點”通過π-π堆積和氫鍵驅動相分離，而二硫鍵作為“間隔基”增強了肽鏈的柔性，促進了分子間相互作用，從而更易形成凝聚體。

圖1 | 肽自組裝形成氧化還原調(diào)控的相變凝聚體示意圖。 肽YHssHY在堿性水溶液中保持可溶單體狀態(tài)（左）。隨著pH降低，肽分子自組裝啟動，通過增強的分子間相互作用形成無膜的液態(tài)液滴（中）。隨后，在辣根過氧化物酶催化下，液態(tài)肽凝聚體逐漸被氧化，形成固態(tài)的半透性凝聚體囊泡。當遇到還原性微環(huán)境（如富含谷胱甘肽的腫瘤組織）時，這些固態(tài)囊泡會恢復為液態(tài)液滴。此外，在各種生理條件下，這種相變可以是可逆和循環(huán)的（右）。

圖2 | 通過液-液相分離形成肽凝聚體。 a) YHssHY在不同肽濃度和鹽濃度下的相圖（pH 6）。實心點表示存在大量凝聚體（濁度>0.2），陰影點表示存在少量凝聚體（濁度0.14-0.2），空心點表示無明顯凝聚體（濁度<0.14）。b) YHssHY在不同pH和肽濃度下的相圖（50 mM NaCl溶液）。比例尺：10 μm。c) pH 6條件下，YHssHY凝聚體濁度隨溫度的變化。d) YHssHY在形成凝聚體過程中的延時圖像（濃度1.0 mg/mL）。觀察到明顯的成核和生長現(xiàn)象，右上角為放大視圖。比例尺：20 μm。e) 顯示YHssHY液滴之間融合的延時圖像。比例尺：5 μm。f) YH和YHssHY組裝體內(nèi)分子相互作用的全原子分子動力學模擬。左圖：700個肽分子在3個不同時間點的快照。右圖：密相內(nèi)相互作用的放大圖，粉色線表示π-π堆積，綠色線表示氫鍵。肽殘基中的原子顏色：氫（白）、氧（紅）、碳（灰）、氮（藍）、硫（橙）。g) 通過等溫滴定量熱法稀釋實驗確定的YHssHY與RNA共組裝形成凝聚體的焓變。

然而，單純的液態(tài)凝聚體生理穩(wěn)定性差，難以直接用于靜脈遞送。受生物氧化過程啟發(fā)，研究人員利用辣根過氧化物酶催化酪氨酸氧化交聯(lián)，成功將液態(tài)凝聚體轉化為固態(tài)的、半透性凝聚體囊泡。原子力顯微鏡測量顯示，氧化后囊泡的楊氏模量提高了63倍，顯著增強了其機械強度。在模擬血液環(huán)境中，未氧化的液態(tài)凝聚體迅速溶解，而氧化形成的固態(tài)囊泡能保持長期穩(wěn)定。更重要的是，通過精確調(diào)控氧化過程中的堿含量，可將這些固態(tài)囊泡的尺寸從微米級調(diào)整至納米級，以滿足靜脈給藥對顆粒尺寸的特定要求，確保其在循環(huán)系統(tǒng)中的滯留和腫瘤部位的富集。

圖3 | 肽凝聚體的相變。 a, b) 氧化前后凝聚體的穩(wěn)定性。凝聚體溶液的延時圖像(a)及其濁度變化(b)。與未氧化凝聚體相比，氧化凝聚體穩(wěn)定性顯著增強。c) 使用原子力顯微鏡測得的氧化前后凝聚體的楊氏模量。每個條件測量不少于9個凝聚體。d) 氧化凝聚體在兔血中表現(xiàn)出增強的穩(wěn)定性（箭頭指示凝聚體）。比例尺：10 μm。e) 氧化前后凝聚體的流體動力學直徑和形態(tài)變化。f) 氧化凝聚體的尺寸穩(wěn)定性。g-i) 使用藻藍蛋白和羅丹明B分別代表生物大分子和小分子，評估YHssHY凝聚體的選擇性滲透性。凝聚體選擇性滲透示意圖(g)，羅丹明B分布在整個凝聚體中(h)，而藻藍蛋白僅觀察到在凝聚體表面(i)。j) YHssHY和YHssHY/siRNA氧化凝聚體的共聚焦顯微鏡圖像，兩者均顯示出明顯的“核-殼”結構——剛性的外層“殼”和富含水的內(nèi)部“核”。k) 標記了羅丹明B的YHssHY氧化凝聚體中心區(qū)域的熒光漂白恢復實驗。比例尺：2 μm。

該肽凝聚體體系的核心優(yōu)勢在于其氧化還原響應的可逆相變能力。谷胱甘肽作為哺乳動物細胞中主要的還原劑，可切割二硫鍵，使固態(tài)囊泡“軟化”并恢復為液態(tài)液滴。研究證實，通過循環(huán)改變氧化/還原環(huán)境，可實現(xiàn)YHssHY凝聚體在“固態(tài)”與“液態(tài)”之間多次可逆切換。這種相變特性直接影響了其細胞攝取行為。實驗發(fā)現(xiàn)，固態(tài)氧化凝聚體主要通過經(jīng)典內(nèi)吞途徑進入細胞，并容易被溶酶體捕獲；而在還原性腫瘤微環(huán)境中，其轉變?yōu)橐簯B(tài)液滴后，則能以不同于傳統(tǒng)內(nèi)吞的方式快速進入細胞，且有效避免了溶酶體陷阱，顯著提升了細胞內(nèi)遞送效率。

圖4 | 氧化還原調(diào)控的肽凝聚體相變。 a) 濁度變化表明YH和YHssHY凝聚體在10 mM GSH還原下的溶解情況。與YH凝聚體相比，YHssHY凝聚體在還原環(huán)境下溶解更快、更明顯。b) 濁度變化表明YHssHY凝聚體的相變。數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差。c) 濁度變化表明氧化的YHssHY凝聚體在不同濃度GSH還原下的溶解情況。d, e) 在循環(huán)氧化和還原環(huán)境下，凝聚體形態(tài)和流體動力學直徑的動態(tài)變化，展示了氧化YHssHY凝聚體的可切換相變。每個數(shù)據(jù)點測量不少于24個凝聚體。比例尺：5 μm。f) SEM圖像顯示液態(tài)YHssHY凝聚體、固態(tài)氧化YHssHY凝聚體以及恢復后的液態(tài)YHssHY凝聚體的形態(tài)，其中氧化凝聚體的尺寸被調(diào)控在納米范圍內(nèi)以便進行SEM成像。

圖5 | 無需溶酶體捕獲的快速內(nèi)吞作用。 a–d) 與固態(tài)氧化凝聚體被溶酶體捕獲相比，液態(tài)凝聚體和恢復的液態(tài)凝聚體（紅色）均未觀察到明顯的溶酶體共定位。細胞核用Hoechst 33258染色（藍色），溶酶體用LysoTracker染色（綠色）。比例尺：10 μm。d) 共聚焦圖像的皮爾遜相關系數(shù)分析。e–g) 液態(tài)凝聚體和固態(tài)氧化凝聚體的細胞內(nèi)遞送效率與商用Lip 2000的比較。共聚焦熒光圖像（左）和ImageJ分析（右）顯示液態(tài)凝聚體和恢復的液態(tài)凝聚體的細胞內(nèi)遞送效率更高。比例尺：20 μm。

基于上述特性，研究團隊進一步構建了負載siRNA的相變肽共凝聚體，用于靶向治療胰腺癌。在體外，液態(tài)siRNA-肽共凝聚體展現(xiàn)出更強的癌細胞增殖抑制能力，這歸因于其高效的細胞攝取。而為了滿足靜脈給藥所需的體內(nèi)穩(wěn)定性，需使用其氧化后的固態(tài)形式。在胰腺癌皮下和原位小鼠模型中，靜脈注射氧化的siRNA-肽共凝聚體后，其固態(tài)結構保證了在血液循環(huán)中的穩(wěn)定性；到達高還原性腫瘤微環(huán)境后，相變?yōu)橐簯B(tài)，促進了siRNA的高效細胞內(nèi)遞送和釋放，從而顯著抑制了腫瘤生長，并下調(diào)了致癌基因KRAS和相關信號通路蛋白的表達。同時，該體系展現(xiàn)了良好的生物相容性和低免疫原性。

圖6 | 針對皮下胰腺癌的相變siRNA-肽共凝聚體。 a) 使用胰腺癌小鼠模型評估相變siRNA-肽共凝聚體治療效率的實驗流程示意圖。b) PANC-1細胞經(jīng)siRNA-肽共凝聚體及其氧化形式處理72小時后的細胞活力。與氧化形式相比，siRNA-肽共凝聚體對胰腺癌細胞的抑制效果增強。c) 熒光標記的siRNA、siRNA-肽共凝聚體及其氧化形式在血液循環(huán)中的穩(wěn)定性評估。樣品靜脈注射后，從小鼠提取血清并分離，檢測熒光強度以代表剩余樣品量。d) 不同處理組小鼠體重的變化。e) 不同處理14天后小鼠的平均腫瘤重量。f) 不同處理14天后從小鼠體內(nèi)剝離的腫瘤照片。g) 腫瘤組織的KI-67、p-AKT、H&E和KRAS染色組織學圖像，顯示細胞凋亡，同時磷酸化AKT水平降低，致癌KRAS表達被抑制。比例尺：100 μm。每組n=6只小鼠。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001。

圖7 | 針對原位胰腺癌的相變siRNA-肽共凝聚體。 a) 使用原位胰腺癌小鼠模型評估相變siRNA-肽共凝聚體治療效率的實驗流程示意圖。b) 不同處理組小鼠體重的變化。c) 不同處理14天后小鼠的平均腫瘤重量。d) 不同處理14天后從小鼠體內(nèi)剝離的腫瘤照片。e) 腫瘤組織的Ki-67、p-AKT和KRAS染色組織學圖像，顯示細胞凋亡，同時磷酸化AKT水平降低，致癌KRAS表達被抑制。比例尺：100 μm。每組n=4只小鼠。f) 小鼠血液中淋巴細胞、中性粒細胞或總白細胞計數(shù)的量化。g) 經(jīng)不同肽-共凝聚體處理的腫瘤組織的Western blot印跡，顯示KRAS表達被沉默。每組n=4只小鼠。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001。

這項研究成功通過設計響應微環(huán)境的肽序列，實現(xiàn)了肽凝聚體液-固態(tài)相變的動態(tài)調(diào)控與循環(huán)切換。這種獨特的相變能力使得研究者能夠精確操控凝聚體的形態(tài)、流動性、機械性能和生理穩(wěn)定性，以適應復雜的病理微環(huán)境，從而實現(xiàn)治療效益最大化。該研究不僅為胰腺癌等疾病的治療提供了一種新型的相變藥物遞送系統(tǒng)，更以其模塊化的肽設計，為構建可模擬或適應天然相分離過程、用于研究和干預一系列細胞活動的生物材料提供了通用性思路，具有廣闊的醫(yī)學與藥學應用前景。