自組裝，最新Nature大子刊！

利用酸讓液滴自我重組

細(xì)胞內(nèi)無膜細(xì)胞器，即生物分子凝聚體，對(duì)細(xì)胞功能至關(guān)重要。這些凝聚體常因應(yīng)生物刺激而展現(xiàn)出復(fù)雜的內(nèi)部形態(tài)，例如具有多層區(qū)室結(jié)構(gòu)的核仁和處理小體。盡管這些內(nèi)部空腔（即液泡）結(jié)構(gòu)在生殖顆粒和核仁等體內(nèi)系統(tǒng)中普遍存在，但細(xì)胞如何形成和維持此類復(fù)雜架構(gòu)的機(jī)制仍不甚明了。體外凝聚體模型為理解這些多相組裝體的形成及其功能提供了重要途徑。

近日，哥倫比亞大學(xué)Allie C. Obermeyer教授和Kyle J. M. Bishop教授合作，瞬態(tài)的pH變化可以驅(qū)動(dòng)酶-聚合物復(fù)合凝聚體內(nèi)部形成中空的液泡區(qū)域。研究發(fā)現(xiàn)，更快的pH降低速率和更大的液滴尺寸會(huì)促進(jìn)凝聚體內(nèi)部液泡的發(fā)育。該過程是一種非平衡過程，由快速pH變化期間凝聚體組分的擴(kuò)散受限交換所驅(qū)動(dòng)。研究者建立了一個(gè)基于物理的定性模型，描述了關(guān)聯(lián)性相分離系統(tǒng)如何響應(yīng)外部條件（尤其是pH）的快速變化。該模型與實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，表明快速的pH變化會(huì)移動(dòng)相邊界，觸發(fā)旋節(jié)線分解，從而誘導(dǎo)凝聚體內(nèi)部形成液泡。這一pH敏感的體外模型闡明了關(guān)聯(lián)性凝聚體中液泡形成的一種機(jī)制，并為了解體內(nèi)多相凝聚體的調(diào)控提供了見解。相關(guān)論文以“Transient pH changes drive vacuole formation in enzyme–polymer condensates”為題，發(fā)表在Nature Chemical Engineering上。

為了探究這一現(xiàn)象，研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一項(xiàng)巧妙的毛細(xì)管實(shí)驗(yàn)。他們利用帶有pH指示劑的凝膠建立pH梯度，實(shí)時(shí)觀測葡萄糖氧化酶與陽離子聚合物DEAE-葡聚糖形成的復(fù)合凝聚體液滴（圖1）。在pH為10時(shí)，這些凝聚體均勻一致；而當(dāng)pH從10快速降至8時(shí)，液滴內(nèi)部出現(xiàn)了明顯的液泡結(jié)構(gòu)。共聚焦顯微鏡圖像清晰地記錄了從均勻液滴到內(nèi)部出現(xiàn)空腔的形態(tài)轉(zhuǎn)變過程（圖1b）。實(shí)驗(yàn)生成的時(shí)空pH分布圖（圖2）揭示了單個(gè)液滴所經(jīng)歷的pH瞬時(shí)變化、其半徑的動(dòng)態(tài)調(diào)整以及通過圖像分析量化出的內(nèi)部角不對(duì)稱性，從而精確定位了液泡開始形成的臨界pH值。

圖1：葡萄糖氧化酶和DEAE-葡聚糖的復(fù)合凝聚體在pH降低時(shí)表現(xiàn)出路徑依賴的液泡形成。 a，陰離子酶葡萄糖氧化酶與陽離子聚合物DEAE-葡聚糖相分離，在pH 10下形成均勻凝聚體。根據(jù)pH降低的速率，在pH 8時(shí)均勻凝聚體可能形成也可能不形成液泡。b，使用Alexa Fluor 594標(biāo)記的葡萄糖氧化酶和未標(biāo)記的DEAE-葡聚糖形成的凝聚體的共聚焦顯微鏡圖像。當(dāng)酸的加入導(dǎo)致pH從10快速降至8時(shí)，發(fā)生液泡形成。比例尺：10 μm。

圖2：利用毛細(xì)管實(shí)驗(yàn)生成時(shí)空pH分布圖。 a，毛細(xì)管實(shí)驗(yàn)的代表性圖像。毛細(xì)管一端包含含有HCl的瓊脂糖凝膠，其余部分充滿pH 10的水中凝聚體溶液。酸液和凝聚體溶液均含有0.2 mg ml?1的pH指示劑木素藍(lán)，用于可視化和量化pH。酶和聚合物的總大分子濃度為1 mg ml?1；酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.76。b，隨著pH降低，一個(gè)代表性液滴中液泡形成隨時(shí)間的顯微鏡圖像。比例尺：10 μm。c，通過分析像素顏色隨時(shí)間監(jiān)測單個(gè)液滴的瞬時(shí)pH。通過pH 8.5處的斜率（實(shí)線）估算單個(gè)液滴經(jīng)歷的pH變化速率。陰影區(qū)域?qū)?yīng)于一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差的置信區(qū)間。d，在距凝膠前沿不同距離處成像，使得pH變化速率的分布得以可視化。e，隨時(shí)間量化單個(gè)液滴的瞬時(shí)半徑。為便于比較，液滴半徑定義為pH 8.5時(shí)的半徑。f，對(duì)不同尺寸的液滴進(jìn)行了成像。僅對(duì)半徑大于3.4 μm（虛線）的凝聚體液滴進(jìn)一步分析液泡形成。g，也從圖像中量化了凝聚體液滴的角不對(duì)稱性，并用于自動(dòng)檢測液泡形成。角不對(duì)稱性首次超過閾值1.2的時(shí)間用于確定液泡形成的pH值，即pH?。h，在分析的200多個(gè)凝聚體液滴中，pH?值各不相同。d、f和h中的四條不同曲線代表在沒有緩沖液的四個(gè)不同毛細(xì)管實(shí)驗(yàn)中的數(shù)據(jù)。每條曲線對(duì)應(yīng)于基礎(chǔ)數(shù)據(jù)分布的核密度估計(jì)，并按每個(gè)實(shí)驗(yàn)中的液滴數(shù)量縮放。灰色陰影區(qū)域給出了總分布以及所有實(shí)驗(yàn)的液滴總數(shù)。

進(jìn)一步的分析揭示了液泡形成的規(guī)律。研究發(fā)現(xiàn)，液泡開始形成的pH值同時(shí)取決于液滴的大小和pH變化的速率（圖3）。在經(jīng)歷相同pH變化的液滴中，更大的液滴會(huì)在更高的pH值時(shí)形成液泡。例如，一個(gè)大液滴在pH 8.5時(shí)便出現(xiàn)液泡，而一個(gè)小液滴則需等到pH降至8.3。同樣，對(duì)于尺寸相近的液滴，經(jīng)歷更快pH下降速率的液滴會(huì)在更高的pH時(shí)形成液泡。這些單調(diào)關(guān)系表明，液泡形成及其前期的液滴收縮都是非平衡過程。

圖3：液泡形成的pH值取決于液滴大小和pH變化速率。 a，在相同速率下pH降低時(shí)，一個(gè)大（11 μm；上圖）和一個(gè)小（7 μm；下圖）液滴隨時(shí)間的代表性顯微鏡圖像。較大的液滴在較高的pH下形成液泡。b，在快速（0.17 min?1；上圖）或慢速（0.05 min?1；下圖）pH降低速率下，相似大小液滴隨時(shí)間的代表性顯微鏡圖像。液泡形成取決于pH變化速率，更快的變化導(dǎo)致在更高的pH下形成液泡。

那么，背后的機(jī)理是什么？熒光漂白恢復(fù)實(shí)驗(yàn)顯示，液滴尺度上聚合物擴(kuò)散的時(shí)間尺度與引發(fā)液泡形成的pH變化時(shí)間尺度相近（圖4a）。這支持了一個(gè)核心假設(shè)：當(dāng)pH變化快于聚合物離子在相間交換的弛豫速度時(shí)，系統(tǒng)便偏離平衡。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖（圖4b）和相應(yīng)的模擬結(jié)果（圖4c）共同描繪了一個(gè)清晰的邊界：當(dāng)pH變化速率足夠慢且液滴足夠小時(shí)，液滴保持均勻；反之，則會(huì)形成液泡。研究者提出的理論模型指出，快速的pH變化會(huì)將系統(tǒng)推入相圖的不穩(wěn)定區(qū)域，通過旋節(jié)線分解引發(fā)液泡形成。

圖4：緩慢的聚合物遷移率和快速的pH變化使液泡形成成為可能。 a，對(duì)凝聚體液滴的FRAP實(shí)驗(yàn)顯示了漂白聚合物在30分鐘內(nèi)的恢復(fù)情況。共聚焦圖像顯示包含未標(biāo)記酶和異硫氰酸熒光素標(biāo)記的DEAE-葡聚糖的漂白凝聚體液滴，其中葡萄糖氧化酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.76，置于補(bǔ)充有20 mM NaCl的10 mM Tris緩沖液（pH 9）中（總大分子濃度：1 mg ml?1）。比例尺：10 μm。對(duì)五個(gè)漂白液滴的歸一化恢復(fù)曲線進(jìn)行雙指數(shù)擬合（實(shí)線）。陰影區(qū)域代表平均強(qiáng)度的±1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。使用雙指數(shù)擬合確定了漂白組分恢復(fù)的較長時(shí)標(biāo)。誤差條表示±1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。漂白區(qū)域直徑為1 μm。b，276個(gè)液滴的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示了液泡形成（空心標(biāo)記點(diǎn)）或均勻內(nèi)部（實(shí)心標(biāo)記點(diǎn)）隨液滴大小和pH變化速率的變化。如果pH變化速率足夠慢且液滴足夠小，則液滴中不會(huì)形成液泡。c，模擬數(shù)據(jù)顯示了不同尺寸液滴經(jīng)歷不同pH變化速率后的情況。

為了驗(yàn)證這一機(jī)制的普適性，研究團(tuán)隊(duì)測試了其他幾種復(fù)合凝聚體系，包括使用不同分子量聚合物的酶-聚合物系統(tǒng)、使用帶負(fù)電GFP變體的系統(tǒng)，以及由RNA和帶正電GFP組成的生物啟發(fā)系統(tǒng)（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2）。結(jié)果顯示，只要體系中含有至少一種弱聚電解質(zhì)，在快速pH變化下都能觀察到依賴于尺寸和速率的液泡形成。然而，并非所有快速變化都導(dǎo)致液泡。模型預(yù)測并實(shí)驗(yàn)證實(shí)，只有當(dāng)pH變化導(dǎo)致聚合物與酶之間的電荷密度比值顯著偏離初始狀態(tài)時(shí)，液泡才容易形成（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3）。反向的pH快速增加（從8到10）即使在大液滴和快速速率下也未引發(fā)液泡，這與模型預(yù)測一致。

擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1：理論與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的比較。 (a) 顯示用于估算實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中緩慢擴(kuò)散率的漂白點(diǎn)尺寸的圖像。(b) 真實(shí)單位下的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。(c) 約化速率和約化半徑空間中的相圖，顯示了數(shù)值模擬（圓形標(biāo)記點(diǎn)）和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（三角形標(biāo)記點(diǎn)）的結(jié)果。陰影區(qū)域代表根據(jù)標(biāo)度分析確定的、液滴發(fā)生液泡形成的理論相空間。黑色實(shí)線表示最慢的擴(kuò)散弛豫速率，虛線標(biāo)記旋節(jié)線生長速率，垂直點(diǎn)線表示它們的交點(diǎn)，對(duì)應(yīng)于臨界半徑。

擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2：在其他復(fù)雜的凝聚體系統(tǒng)中也觀察到pH誘導(dǎo)的液泡形成。 總結(jié)了在三個(gè)互補(bǔ)的復(fù)雜凝聚體系（較低分子量的DEAE-葡聚糖與葡萄糖氧化酶；帶負(fù)電GFP變體與DEAE-葡聚糖；帶正電GFP與RNA）中觀察到的依賴于尺寸和速率的液泡形成。

擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3：模擬和實(shí)驗(yàn)顯示反向的pH變化不會(huì)導(dǎo)致液泡形成。 (a) 正文圖4所示模型在pH 8和10下的平衡相圖。紅色曲線顯示了pH從10降至8時(shí)密相組分的兩步弛豫；藍(lán)色曲線顯示了pH從8增至10時(shí)的兩步弛豫。(b) 瞬時(shí)pH增加的1D模擬顯示沒有液泡形成；瞬時(shí)pH降低的結(jié)果顯示在圖S19a和S19b中。盒子尺寸L=8192；密相的體積分?jǐn)?shù)在pH 8時(shí)為0.0544，在pH 10時(shí)為0.0957。(c) pH從8快速增加到10的pH軌跡。陰影區(qū)域?qū)?yīng)于1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差的置信區(qū)間。葡萄糖氧化酶和DEAE-葡聚糖凝聚體在含20 mM NaCl、pH 8的水中制備，酶濃度為0.76 mg/mL，聚合物濃度為0.24 mg/mL。使用了10 mM NaOH瓊脂糖凝膠。(d) 作為液滴大小和pH變化速率函數(shù)分析的104個(gè)液滴的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，均勻液滴用實(shí)心標(biāo)記點(diǎn)表示。即使pH變化速率足夠快且液滴足夠大，液滴中也不會(huì)形成液泡。

這項(xiàng)研究結(jié)果表明，復(fù)合凝聚體液滴中的液泡形成是一個(gè)由快速pH變化期間多離子在相間擴(kuò)散受限交換所驅(qū)動(dòng)的非平衡過程。一個(gè)定性模型支持了這些發(fā)現(xiàn)，表明其機(jī)制是旋節(jié)線分解。當(dāng)凝聚體系進(jìn)入不穩(wěn)定區(qū)域且不穩(wěn)定性增長速度超過向新平衡組成擴(kuò)散弛豫的速率時(shí)，液泡便會(huì)形成。該研究建立的毛細(xì)管實(shí)驗(yàn)方法，為研究類似凝聚體系統(tǒng)中的液泡動(dòng)力學(xué)提供了穩(wěn)健的平臺(tái)。在非平衡條件下體外控制凝聚體結(jié)構(gòu)，有助于理解細(xì)胞如何主動(dòng)調(diào)節(jié)內(nèi)源性多相凝聚體的結(jié)構(gòu)。此外，具有可調(diào)內(nèi)部結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)性凝聚體，在合成生物學(xué)中具有廣闊的應(yīng)用前景。