Plos Pathogens丨彭辰團(tuán)隊揭示痘病毒病毒工廠組裝新機(jī)制

近日，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院動物疫病快速診斷技術(shù)實驗室在微生物學(xué)期刊PLoSPathogens上在線發(fā)表了題為Poxvirus H5 mediates the formation of liquid-liquid phase separation condensates which promote virus factory assembly的研究論文。該研究揭示了牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒（Lumpy skin disease virus, LSDV）、痘苗病毒（Vaccinia virus, VACV）等痘病毒的H5蛋白通過誘導(dǎo)液-液相分離（liquid-liquid phase separation, LLPS）機(jī)制促進(jìn)病毒工廠（virus factory）形成的分子基礎(chǔ)，為理解大型DNA病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的空間組織和復(fù)制機(jī)制提供了新的視角。

痘病毒（Poxviridae）是最復(fù)雜的DNA病毒家族之一，能夠在細(xì)胞質(zhì)中完成整個復(fù)制周期。痘病毒感染后，病毒基因組、復(fù)制蛋白與宿主因子共同組裝成被稱為病毒工廠的細(xì)胞質(zhì)區(qū)室，在此區(qū)域中進(jìn)行病毒DNA復(fù)制、蛋白合成及病毒粒子裝配。然而，病毒工廠的精確組裝機(jī)制長期未明。同時需要指出的是，痘病毒家族中還包括近年來對全球養(yǎng)牛業(yè)造成重大影響的LSDV。本研究揭示的相分離機(jī)制不僅適用于VACV，也為理解LSDV的復(fù)制與病毒工廠形成提供了重要參考，為其防控與疫苗研發(fā)提供了新的理論依據(jù)。

研究團(tuán)隊首先利用生物信息學(xué)預(yù)測對VACV全基因組進(jìn)行系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)H5蛋白在其N端區(qū)域富含顯著的固有無序區(qū)（Intrinsically Disordered Region, IDR），這一特征常見于能夠介導(dǎo)LLPS的關(guān)鍵調(diào)控蛋白?；谶@一線索，科研人員構(gòu)建了帶有熒光標(biāo)簽的H5融合蛋白，并在活細(xì)胞中觀察其亞細(xì)胞分布。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H5蛋白在細(xì)胞質(zhì)中能夠自發(fā)形成圓形或橢圓形的微小液滴結(jié)構(gòu)，而非均一分布。進(jìn)一步的熒光恢復(fù)實驗（FRAP）表明，H5液滴在光漂白后熒光信號可于短時間內(nèi)迅速恢復(fù)，顯示出顯著的動態(tài)交換性與流動性，這正是LLPS凝聚體的重要特征。相比之下，對照蛋白M45雖可形成點狀結(jié)構(gòu)，卻幾乎無熒光恢復(fù)現(xiàn)象，說明其不具備相分離能力。為了驗證H5液滴的物理性質(zhì)，研究團(tuán)隊進(jìn)一步使用丙二醇（1,2-propylene glycol, PG）處理細(xì)胞——這一化合物可破壞弱相互作用，從而抑制液-液相分離。結(jié)果顯示，PG處理后H5液滴的熒光恢復(fù)被顯著抑制，動態(tài)性喪失，而液滴的形態(tài)仍然存在，提示這些凝聚體不僅是簡單的蛋白聚集體，而是具有典型LLPS特征的動態(tài)生物相分離結(jié)構(gòu)。這些發(fā)現(xiàn)首次揭示了痘病毒H5蛋白具備液-液相分離能力，為理解痘病毒在宿主細(xì)胞中組裝病毒工廠的分子基礎(chǔ)提供了新的思路。

隨后，研究團(tuán)隊通過系統(tǒng)性篩選發(fā)現(xiàn)，H5蛋白N端的兩個關(guān)鍵磷酸化位點（S127和S130）在調(diào)控其液-液相分離行為中發(fā)揮核心作用。構(gòu)建相應(yīng)的點突變體（H5S127A/S130A）后，研究人員發(fā)現(xiàn)突變體雖然仍能在細(xì)胞中形成點狀結(jié)構(gòu)，但失去了熒光漂白后的動態(tài)恢復(fù)能力，LLPS特性完全消失。進(jìn)一步的生化實驗顯示，S127/130突變顯著削弱了H5的多聚化能力及其與雙鏈DNA的結(jié)合強(qiáng)度，表明這兩個磷酸化位點通過促進(jìn)蛋白之間的高階聚集及核酸結(jié)合，共同驅(qū)動相分離過程的發(fā)生。更重要的是，失去LLPS能力的H5突變體在病毒感染過程中表現(xiàn)出明顯功能缺陷。利用H5缺失的VACV-WR（WRΔH5）作為模型，研究人員發(fā)現(xiàn)病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)幾乎無法正常完成DNA復(fù)制和病毒工廠組裝。而補(bǔ)回野生型H5能夠有效恢復(fù)這一過程，使病毒工廠呈現(xiàn)典型的大顆粒狀結(jié)構(gòu)；相比之下，表達(dá)S127/130突變體的細(xì)胞則僅能形成體積更小、結(jié)構(gòu)紊亂的病毒工廠，數(shù)量也顯著減少。上述結(jié)果表明，H5通過磷酸化驅(qū)動的相分離行為在病毒工廠的構(gòu)建與成熟中發(fā)揮“支架平臺”的關(guān)鍵作用，其動態(tài)凝聚能力是痘病毒復(fù)制周期的重要基礎(chǔ)。

H5通過介導(dǎo)液-液相分離促進(jìn)病毒工廠的組裝

該研究證明，痘病毒H5蛋白通過磷酸化調(diào)控的液-液相分離機(jī)制，整合病毒DNA、復(fù)制因子及宿主蛋白共同驅(qū)動病毒工廠的組裝與成熟，揭示了痘病毒復(fù)制區(qū)形成的物理化學(xué)新原理。這一發(fā)現(xiàn)為解析大型DNA病毒的空間組織機(jī)制及其潛在干預(yù)靶點提供了新的研究思路。值得強(qiáng)調(diào)的是，由于H5蛋白在痘病毒屬中高度保守，本研究揭示的相分離驅(qū)動機(jī)制不僅適用于經(jīng)典模型病毒VACV，也為解析LSDV等重要畜牧業(yè)病原的復(fù)制過程提供了關(guān)鍵突破口。相關(guān)機(jī)制有望被用于開發(fā)LSDV的抗病毒抑制策略、復(fù)制阻斷技術(shù)及高效疫苗抗原設(shè)計，為牛結(jié)節(jié)性皮膚病的精準(zhǔn)防控提供新的科學(xué)依據(jù)。

中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院為該論文的第一完成單位，朱俊達(dá)博士和張子卉博士為論文共同第一作者，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院彭辰教授為本文通訊作者。該研究依托獸醫(yī)公共衛(wèi)生安全全國重點實驗室完成。

原文鏈接：https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1013708

制版人：十一

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